JournalofInnerMongoliaUniversityforNationalities
Vol.31No.4July.2016
2016年7月
DOI:10.14045/j.cnki.15-1220.2016.04.004
氯磺酸-吡啶法酯化修饰海参岩藻聚糖硫酸酯的研究
王瑞芳，吴光斌，谢远红，陈素艳，李莉莉
（集美大学食品与生物工程学院，福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021）〔摘
要〕用氯磺酸-吡啶法对海参岩藻聚糖硫酸酯进行酯化修饰，考察了硫酸酯化剂比例、反应温度及反应
时间对酯化效果的影响.通过正交实验，优选出最佳酯化工艺条件：吡啶与氯磺酸体积比为1:1，反应温度为50℃，反应时间为2h；硫酸基的含量由10.75%可提高至59.53%；红外光谱分析结果显示，酯化后硫酸酯的特征吸收峰显著增强.抗氧化活性测定显示，硫酸酯化海参岩藻聚糖硫酸酯对DPPH自由基和羟基自由基的清除率均显著提高.
〔关键词〕海参岩藻聚糖硫酸酯；硫酸酯化；抗氧化活性〔中图分类号〕0629〔文献标识码〕A〔文章编号〕1671-0185（2016）04-0288-05StudiesonSulfatedModificationofSeaCucumber
FucoidanbyChlorosulfonicAcid-pyridineMethod
WANGRui-fang，WUGuang-bin，XIEYuan-hong，CHENSu-yan，LILi-li（CollegeofBio-engineering，JimeiUniversity，FujianProvincialKeyLaboratoryofFoodMicrobiologyandEnzymeEngineering，Xiamen361021，China）Abstract:Sulfatedseacucumberfucoidan（SSC-FUC）waspreparedbythereactionofseacucumberfucoidan
（SC-FUC）withchlorosulfonicacid-pyridine.Theeffectsofesterificationagentratio，reactiontimeandreactiontemperatureonsulfationpropertieswerestudiedbyorthogonaltestdesignaimingtodiscusstheoptimizedsulfatedesterifyingtechnologyforSSC-FUC.TheoptimizedpreparationconditionforSSC-FUCwereobtainedasvolumera-tioofchlorosulfonicacidtopyridine1:1，reactiontime2handreactiontemperature50℃.Thesulfurcontentcouldreach59.53%from10.75%.FTIRsuggestedthatthecharacteristicabsorptionpeakofsulfatesignificantlyenhanced.Anti-oxidationanalysisrevealedthatabilityofSSC-FUConscavengingDPPHandhydroxylradicalhadbeenim-provedalot.
Keywords:Seacucumberfucoidan;Sulfation;Antioxidantavtivity
多糖硫酸酯化后可提高多糖的水溶性、增加其抗病毒活性中起重要作用的负电荷、改变多糖的空间立体结构，从而使其表现出更为广泛的生物学活性，如抗凝血、增强免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等〔1~7〕.自发现硫酸酯化多糖可抑制艾滋病病毒（HIV）的活性以来〔8~11〕，多糖硫酸酯化研究已成为多糖研究领域的热点.
海参岩藻聚糖硫酸酯（seacucumberfucoidan，SC-FUC）是一类主要有岩藻糖及硫酸酯基团组成的多糖类物质，具有抗凝血、增强免疫、抗胃溃疡、抗氧化等多种功能〔12~18〕.而低值海参（海地瓜）口感差，精深加工产品少，资源利用不充分，SC-FUC的提取是实现其资源有效利用的重要途径之一.本研究组以低值海参为原料，经酶解提取、膜分离、醇沉、冻干后得SC-FUC粗品，其硫酸基含量为10.75%.本文以此粗品为原料，进一步硫酸酯化，研究硫酸酯化的工艺条件对酯化效果的影响，并考察了SC-FUC酯化前、酯化后清除DPPH自由基和羟基自由基的能力，以期了解酯化修饰对SC-FUC抗氧化活性的影响.所采用的酯化方法为氯磺酸-吡啶法〔19~23〕，N，N-二甲基甲酰胺为分散剂.关于SC-FUC的硫酸酯化研究，目前还未见相关报道.
基金项目：福建省教育厅科技项目（JA14172）
作者简介：王瑞芳，集美大学食品与生物工程学院副教授，博士.
第4期王瑞芳等：氯磺酸-吡啶法酯化修饰海参岩藻聚糖硫酸酯的研究289
1材料与方法
1.1试剂材料海参岩藻聚糖硫酸酯粗品（硫酸基含量为10.75%），为本实验室自制；N，N-二甲基甲酰
胺（DMF）、氯磺酸、吡啶、氢氧化钠、乙醇等试剂，均为分析纯.1.2仪器设备
旋转蒸发仪（RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂）；真空冷冻干燥机（JDG-0.2B型，兰州
科近真空冻干技术有限公司）；傅里叶红外光谱仪（FT/IR-480型，日本岛津公司）；紫外可见分光光度计（Cary50型，美国Varian公司）；磁力加热搅拌器（WCT-200型，常州国华电）.1.3海参岩藻聚糖硫酸酯的酯化
1.3.1酯化试剂的制备：无水吡啶置于150mL锥形瓶中，冰水浴冷却至0℃，磁力搅拌下按照一定比例缓慢滴加氯磺酸，得淡黄色酯化试剂，现配现用.1.3.2酯化反应：取10mLDMF置于制备酯化剂的反应瓶中，加热至反应温度，磁力搅拌下加入100mg的SC-FUC粗品，保温反应一定时间；反应结束后滴加2mol/LNaOH水溶液至pH值为7.然后装入透析袋透析72h.旋蒸浓缩10倍后加入三倍体积的95%乙醇，4℃下醇沉24h，离心分离后将沉淀冷冻干燥，得到硫酸酯化海参岩藻聚糖硫酸酯（sulfatedseacucumberfucoidan，SSC-FUC）.1.4硫酸基含量的测定
采用明胶-比浊法〔24〕测定硫酸基的含量.首先以硫酸钾为标准品制作标准曲线，
得出吸光度（Y）对硫酸基浓度（X）的一元线性回归方程：Y=0.7030X+0.0148，R2=0.9992，线性范围:0～0.6mmol/L，然后精确称取各样品，按照明胶-比浊法的操作步骤进行测定，根据标准曲线求出各样品中硫酸基的量.
1.5红外光谱分析红外扫描.
1.6SC-FUC和SSC-FUC抗氧化活性的测定清除1，1-二苯基-苦肼基自由基（DPPH·）的测定：取各浓度的样品溶液2.0mL和0.1mmol/L的DPPH·-乙醇溶液2.0mL，充分混合均匀，在室温下避光静置30min，在波长517nm处测得吸光值记为A（）.按照相同的操作方法，以2.0mL无水乙醇S用50%的乙醇调零代替DPPH·-乙醇溶液，吸光值记为A；以2.0mL无水乙醇代替样品溶液，吸光值记为A0.DPPH·清除率计算公式见式1.
AS-A0×100%（1）A清除羟基自由基（·OH）的测定：反应体系依次加入1.0mL磷酸盐缓冲液（pH7.40，1mol/L）、1.0mL番
DPPH·清除率=
称取SC-FUC和SSC-FUC适量，分别与KBr研磨压片，在500~4000cm-1范围内进行
（1mmol/L）、0.5mL各浓度样品溶液以及1mL3%H2O2红花红试剂（100μg/mL）、1.0mLEDTA-Fe2+试剂溶液，混合均匀，37℃下保温静置30min，波长520nm处测得吸光值记为A（用1.0mL磷酸盐缓冲液加S3.5mL蒸馏水调零）.按照相同的操作方法，以1.5mL蒸馏水代替样品和H2O2溶液，吸光值记为A；以0.5mL蒸馏水代替样品，吸光值记为A0·.OH清除率计算公式见式2.
As-A0)×100%⋅OH清除率=（1-A（2）
2结果与分析
2.1海参岩藻聚糖硫酸酯酯化的单因素试验结果
2.1.1酯化剂的比例对硫酸酯化效果的影响：调节吡啶和氯磺酸的体积比为0.6:1、1:1、1.67:1、3:1，30℃
下反应1h，考察不同酯化剂比例对硫酸酯化效果的影响.实验结果如图1所示，硫酸基含量随着两者比例的增加先上升后下降.氯磺酸是一种强酸性物质，当体积比0.6:1时，反应体系中氯磺酸的含量太高，酸性太强，多糖部分降解，影响了硫酸酯化的效果.但当吡啶和氯磺酸的体积大于1:1时，硫酸基含量随着两者比例的增加而迅速下降.吡啶和氯磺酸的体积比太大或太小，都会影响硫酸酯化的效果.2.1.2反应温度对硫酸酯化效果的影响：调节吡啶和氯磺酸的体积比为0.6:1，分别在30℃、50℃、70℃和90℃下反应1h，考察反应温度对硫酸酯化效果的影响.
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图1酯化剂比例对硫酸基含量的影响Figure1Effectofesterificationagent
ratioonsulfurcontent
图2反应温度对硫酸基含量的影响
Figure2Effectofreactiontemperatureonsulfurcontent
由图2可以看出，在温度低于50℃时，随着反应温度的增加，硫酸基含量逐渐升高；在50℃时，硫酸基含量最高达到23.82%，但当温度从70℃升至90℃时，硫酸基含量却有所下降.原因可能在于：海参岩藻聚糖在高温的酸性环境下，发生了降解，导致了硫酸基含量先升高后降低的现象.
2.1.3反应时间对硫酸酯化效果的影响调节吡啶和氯磺酸的体积比为0.6:1，30℃下分别反应1、2、3、4h，考察反应时间对硫酸酯化效果的影响.
图3可见，当酯化温度和酯化剂配比一定时，随着反应时间的增加，硫酸基含量先升高后有所下降.一定范围内，酯化时间增加，有助于酯化反应的进行；但是在高酸性的条件下，酯化时间过长，也会引起多糖的部分降解，导致酯化度有所下降.2.2海参岩藻聚糖硫酸酯酯化正交试验结果实验结果列于表1.
表1正交试验设计及结果
Table1Designandresultsoforthogonaltest实验号123456789K1K2K3R吡啶：氯磺酸A0.6:10.6:10.6:11:11:11:11.67:11.67:11.67:131.7646.3436.4114.58反应温度/℃B30507030507030507038.4939.6536.373.28反应时间/hC12331223129.0245.3840.1116.360硫酸基含量/%14.745.2335.3257.2841.5640.1743.4632.1633.62图3反应时间对硫酸基含量的影响Figure3Effectofreactiontimeon
sulfurcontent5
在单因素实验的基础上，采用正交实验法确定SC-FUC硫
3酸酯化的工艺条件.按照氯磺酸与吡啶的体积比、反应温度和反应时间做三因素三水平L（正交试验，93）
第4期王瑞芳等：氯磺酸-吡啶法酯化修饰海参岩藻聚糖硫酸酯的研究291
图4SC-FUC和SSC-FUC的红外光谱图Figure.4InfraredspectraofSC-FUCandSSC-FUC
图5SC-FUC和SSC-FUC对DPPH·及·OH的清除效果
Figure5ScavengingeffectofSC-FUCand
SSC-FUConfreeradicals
由表1可以看出：运用氯磺酸-吡啶法进行SC-FUC的酯化修饰，影响酯化反应因素的主次顺序为C>A>B，即反应时间对酯化度影响最大，其次是酯化剂的比例和反应温度.最佳工艺组合为A2B2C2，即吡啶和氯磺酸的体积比为1∶1，反应温度为50℃，反应时间为2h，该工艺组合不在正交设计表中，故需作验
证试验，验证结果显示，在此最佳工艺条件下，SC-FUC酯化后硫酸基的含量可达到59.53%.2.3红外光谱分析图4为SC-FUC和SSC-FUC的红外光谱图，图中3422cm-1（O-H及N-H的伸缩振动峰）、2936cm-1（C-H伸缩振动峰）、1654cm-1（C=O的伸缩振动峰）和1045cm-1（C-O-C的伸缩振动峰）都是多糖的特征吸收峰，而1240cm-1（S=O伸缩振动峰）和848cm-1（C-O-S的伸缩振动峰）是硫酸酯的特征吸收
26〕峰〔25，，酯化后硫酸酯的特征吸收峰显著增强.
2.4SC-FUC和SSC-FUC的抗氧化活性不同浓度的SC-FUC和SSC-FUC溶液对DPPH·及·OH的清除效果如图5所示.从图5可看出，随溶液浓度的上升，两种糖对DPPH·及·OH的清除效果均增大；SSC-FUC对DPPH·及·OH的清除效果显著优于SC-FUC，由此可见SC-FUC硫酸化修饰后抗氧化活性显著提高.可能是因为糖链引入硫酸基后，分子极性增强，由于静电排斥使糖链较为伸展，黏度降低，更易与自由基结合〔27~29〕.
3结论
采用氯磺酸-吡啶法可对SC-FUC进行酯化改性，其最佳酯化条件为：吡啶和氯磺酸的体积比为1∶1，反应温度为50℃，反应时间为2h；硫酸基的含量由10.75%可提高至59.53%.傅立叶红外光谱分析结果表明，酯化后硫酸酯的特征吸收峰显著增强.抗氧化活性测定显示，SC-FUC的酯化改性利于其抗氧化活性的提高.
参
考
文
献
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〔责任编辑郑瑛〕
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