细胞培养技术的增殖

发布网友 发布时间：2022-04-23 17:33

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热心网友 时间：2022-07-15 06:36

培养细胞的生存环境是培养瓶、器皿或其他容器，生存空间及营养是有限的。当细胞增殖到一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一过程称之为“传代”(passage或subculture)。
值得注意的是：每次传代细胞在生长和增殖方面受到一定的影响。 指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。一般根据细胞种类、性状和原供体的年龄的情况而定。
如：二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生命，细胞便开始凋亡(apoptosis)。 细胞在生存过程中经历以下三个阶段
1.原代培养期(primary culture)
组织到第一次传代时间大约为1～4周
特点：
细胞移动活跃,但*不旺盛,多呈二倍体核型。
原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。
各细胞的遗传性状互不相关，细胞相互依存性强，如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养,细胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明细胞生存性差。
2.传代期(passage)
初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cell line)
特点：
细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也叫二倍体细胞系(diploid cell line)为了保存二倍体细胞性质，细胞应在初代或传代早期冻存为好。
一般细胞在10代以内冻存。
冻存配方：
向培养液加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。
存于在液氮中温度可达到－196℃，可长期储存。如解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞性状不受影响，成为保存细胞最主要的手段。
3.衰退期
特点：细胞仍生存 增殖减慢 不增殖 轮廓增强 衰退凋亡
注意：细胞在三期中的任何一期（一般发生在传代后期或衰退期）在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化(spontaneous transformation);
细胞可能获得永生性(immortality) 或称为恶性性(malignancy)。细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系(continuous cell line)。而细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。 “ 一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段：
1. 潜伏期(latent phase) ：
接种 经过 悬浮期(细胞质回缩,胞体呈圆球形) 贴壁。
初代培养细胞 经过 10～24小时或更多时间。
连续细胞系和癌细胞系 经过 10～30分钟 贴附。
贴附现象是一个非常复杂和受多种因素的影响。
影响细胞贴附：底物表面不干净，影响细胞贴附。
利于细胞贴附：底物表面带有阳性物质与特殊物质:
纤粘连蛋白(fibronectin FN)、
细胞表面蛋白(cell surface proteinCSP)
这些物质有的存在与细胞表面,有的来自血清。
潜伏期特点：
长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。
(1)细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。少见*相，细胞有运动活动。
(2)初代培养 细胞潜伏期约为24～96小时或更长，
连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6～24小时。
(3)细胞接种密度大潜伏期短。
(4)细胞出现*相增多时，标志细胞进入指数增生期。
2．指数增生期(logarithmic growth phase)：
特点：细胞增殖最旺盛阶段,*相增多。
细胞*指数(mitotie index MI) ：
表示每1000个细胞中的*相数。
条件：*相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。
细胞*指数：
初代细胞：在0.1%～0.5%之间% ,
连续*细胞和肿瘤细胞：3 ～5%。
指数增生期是作为细胞一代活力最好的时期,是进行实验最好和最主要的阶段。
指数增生期持续3～5天，细胞数量增多后生长空间变小，细胞相互接触可连接成片。
正常细胞：细胞相互接触能抑制细胞运动，这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。
肿瘤细胞：没有这种现象，可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展，使细胞发生堆积(piled up)。
由于细胞不断增殖*，细胞数量持续增多，培养液的营养成分减少，代谢产物增多，细胞受营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(Density inhibition),导致细胞*停止。
3.停滞期(stagnate phase)
细胞量和密度达到饱和，细胞停滞增殖。表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平，也称为平顶期(plateau）。
特点：细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。
注意：
传代过晚将影响下一代细胞的生长,至少要再传 1～2代 ,通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。
在这一点上要特别注意。